背景^[1-3]

甲苯胺蓝(Toluidine Blue O)是一种常用的人工合成染料,属于醌亚胺染料类,这类染料主要含有胺基和醌型苯环两个发色团，从而成色原显色。甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。甲苯胺蓝还含有两个助色团，能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色，可染细胞核使之呈蓝色。另外，肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质，遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，临床上经常用于肥大细胞染色。

甲苯胺蓝染色液(细胞专用)适用于细胞内酸性黏液多糖染色，尤其适用于含硫的酸性黏液物质染色，染色后酸性黏多糖呈红色。

操作步骤：

1、细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定15s，取出放在纸巾上。

2、滴加甲苯胺蓝染色液(细胞专用)进行滴染5min。

3、滴加等量蒸馏水于涂片上混匀，染色15min。

4、水洗、晾干、镜检。

染色结果：细胞内酸性黏液多糖呈红色。

注意事项：

为了证实染色效果，可选用慢性粒细胞白血病血片(嗜酸性粒细胞)或再生障碍性贫血骨髓涂片(组织嗜酸性粒细胞)作对照。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

应用^[4][5]

用于Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白对人软骨细胞生物学特性的影响研究

通过观察三种培养板中人软骨细胞的生物学特性，了解Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白对体外培养的人软骨细胞的生物学特性的影响。

方法：软骨组织标本来自于因股骨颈骨折行全髋置换术的患者。在实验室经过Ⅱ型胶原酶一步消化卡博特炭黑法处理关节软骨后进行体外单层培养获得大量软骨细胞，经过3个月软骨细胞培养传代至第7代，记为P0—P7，相差光镜下观察细胞形态，选择第三代软骨细胞进行研究。细胞计数后分别加入普通培养板（普通板），Ⅰ型胶原蛋白包被的培养板（Ⅰ型）、Ⅱ型胶原蛋白包被培养板（Ⅱ型）继续培养。

通过评价细胞活性、倍增时间、相差光镜观察细胞形态来分析细胞培养结果，通过ELISA技术、甲苯胺蓝染色来鉴定软骨细胞表型，PCR技术、糖胺多糖定量检测来了解软骨细胞在三种培养板中分化增殖能力。

结果：(1)收集20例符合标准的关节软骨标本，选择培养后细胞形态正常、活性强的10组软骨细胞进行试验。

（2）从倒置相差显微镜下观察细胞形态，刚消化好未贴壁软骨细胞呈圆形，贴壁后细胞大小变化不大呈多角形。传代后，细胞逐渐伸长，变大，随着传代数增加，细胞逐渐呈长梭形，类似成纤维细胞，前三代软骨细胞具有明显增殖活性，细胞形态相似，从第4代开始逐渐变为长梭形，到第7代，软骨细胞完成变为成纤维细胞。

（3）将第3代软骨细胞分别加入Ⅰ型、Ⅱ型和普通板后继续培养7天后观察，发现Ⅱ型中软骨细胞数量最多，且增殖速度为Ⅰ型的2倍，普通板的5倍，该结果提示其增殖速度较快。

检测三种不同培养板中软骨细胞分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的量，发现Ⅱ型中软骨细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白最少，且与普通板检测结果差异有统计学意义（P<0.01），而与Ⅰ型板检测结果差异无统计学意义；Ⅱ型板中软骨细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白量最多，与其他两种培养板检测结果的差异均具有统计学意义（P<0.01）；甲苯胺蓝染色及DMMB比色法定量检测软骨细胞分泌糖胺多糖的量，发现Ⅱ型板上软骨细胞分泌糖胺多糖最多，与Ⅰ型板、普通板检测结果差异具有统计学意义（P<0.01）。

参考文献

[1]Matrix-induced autologous chondrocyte implantation versus microfracture in the treatment of cartilage defects of the knee:a 2-year randomised study[J].Erhan Basad,Bernd Ishaque,Georg Bachmann,Henning Stürz,Jürgen Steinmeyer.Knee Surgery,Sports Traumatology,Arthroscopy.2010(4)

[2]Treatment of full thickness chondral lesions of the knee with microfracture in a group of athletes[J].Alberto Gobbi,Perrico Nunag,Konrad Malinowski.Knee Surgery,Sports Traumatology,Arthroscopy.2005(3)

[3]Crosslinked type II collagen matrices:preparation,characterization,and potential for cartilage engineering[J].J.S.Pieper,P.M.van der Kraan,T.Hafmans,J.Kamp,P.Buma,J.L.C.van Susante,W.B.van den Berg,J.H.Veerkamp,T.H.van Kuppevelt.Biomaterials.2002(15)

[4]Phenotypic differences in murine chondrocyte cell lines derived fr硅油乳液om mature articular cartilage[J].H.M.van Beuningen,R.Stoop,P.Buma,N.Takahashi,P.M.van der Kraan,W.B.van Den Berg.Osteoarthritis and Cartilage.2002(12)

[5]蒋萍.Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白对人软骨细胞生物学特性的影响[D].川北医学院,2012.