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微丝染色液(R250法)的原理和操作步骤
背景及概述[1-2]
微丝是肌动蛋白组成的纤维状细胞器。直径5~8nm,成束存在或散在分布。微丝在细胞质中是一种动态结构,肌动蛋白单体呈球状(G-肌动蛋白),在适宜条件下可装配成丝状(F-肌动蛋白),并由两条F-肌动蛋白缠绕成双螺旋结构,即微丝。由于G-肌动蛋白与F-肌动蛋白可相互转化,微丝并不稳定,易受多种因素影响,如细胞松弛素B可抑制微丝的装配,而鬼笔环肽则可抑制其解聚。微丝在所有细胞中参与组成细胞骨架,有保持细胞形状和维持细胞结构稳定性的作用。微丝还能参与细胞的运动,但当其单独存在时无收缩作用,必须有收缩蛋白,特别是肌球蛋白存在时才能收缩。
一般认为,在非肌肉细胞中,微丝可推动细胞质流动,参与细胞的变形运动,胞吞作用与胞饮作用等。分布在微绒毛中的微丝还可引起微绒毛伸缩和摆动。在肌肉细胞中则参与构成细肌丝,与主要由肌球蛋白组成的粗肌丝一起实现肌肉细胞的收缩功能。微丝染色液(R250法)在染色过程中由于微观结构不稳定,有些纤维在光学显微镜下无法辨认,因此能够看到的纤维主要是由微丝组成的应力纤维。微丝染色液(R250法)主要显示由微丝构成的应力纤维,由于细胞对细胞基质的附着和维持扁平铺展的形状,该纤维在体外培养的贴壁细胞中尤其发达。
组成[2]
操作步骤[2]
1、取材:用去离子水稀释PBSbuffer(*10)至1*。轻轻撕取约1厘米洋葱鳞茎内皮,孵育,使其下沉。
2、抽提:弃PBSbuffer,加入TMbuffer,盖上称量瓶盖子37℃处理。
3、漂洗:弃TMbuffer,用去离子水稀释Mbuffer(3×)至1×,用1×Mbuffer清洗。
4、固定:稍微晾干,加入Microfilamentfluid固定细胞。
5、冲洗:弃Microfilamentfluid,用1×Mbuffer清水洗高岭土价格洗。
6、染色:弃PBSbuffer,把盖玻片立于吸水滤纸上吸去边缘水分,加入R250stainingsolution染色。
7、去离子水冲洗染液,标本铺常用抗氧剂在载玻片上,加盖玻片,镜检。
注意事项[2]
动物细胞微丝微丝染色液(R250法)染色时,向称量瓶中加入试剂应缓慢,避免直接滴到玻片或样本上;清洗细胞动作应轻柔,避免细胞脱落。
主要参考资料
[1] 兽医大辞典
[2] 微丝染色液(R250法)操作说明
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