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碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)的成分组成和操作步骤
背景及概述[1]
碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶,广泛分布于哺乳动物组织内,其活性所需最适pH9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜),如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮,还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉色素碳黑淀法来显示碱性磷酸酶活性,而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法),其原理是在pH9.2~9.8的碱性条件下,细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解,释放出磷酸不萘酚,后者不偶联重氮盐生成有色产物,定位于细胞质中。碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后对甲苯磺酸酐的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨,结果较金属盐沉淀法可靠。
组成[1]
操作步骤[1]
一、涂片或切片
1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蜡切片无需固定),水洗。
2、滴加配制好的碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法),放入湿盒中,避光孵育15~20min,水洗。
3、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3~5min。
4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。
二、贴壁培养细胞
1、取6孔板或其他容器培养的细胞,弃液,PBS清洗干净
2、加入碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)固定3min或4%多聚甲醛固定10~15min,PBS清洗。
3、滴加配制好的碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法),放入湿盒中,避光孵育15~20min,PBS清洗。
4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3~5min。
5、PBS清洗、镜检。
染色结果[1]
ALP活性部位蓝色
细胞核红色(核固红)或绿色(甲基绿)
血液、骨髓涂片
注意事项[1]
1.血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜,薄厚适宜,及时固定,否则会影响酶的活性。
2.培养细胞染色操作过程中,清洗、染色等步骤都应轻微,以免损伤或丢失细胞。
3.ALP孵育液易失效或降低阳性强度,即配即用,不宜久置。
4.复染时,核固红染色液或甲基绿染色液二者取其一。
5.每次染色时,应有阳性对照片。
主要参考资料
[1]碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)操作说明
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