背景^[1-5]

TMB是用于免疫组织化学染色程序的生色底物，以及用于酶联免疫吸附测定（ELISA）的可视化试剂。TMB是白色结晶粉末，在与乙酸乙酯的溶液中形成淡蓝绿色液体。TMB因阳光和荧光灯而退化。TMB可以作为氢供体，通过过氧化物酶如辣根过氧化物酶将过氧化氢还原成水。TMB的氧化显示3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化成3,3'，5,5'-四甲基联苯胺二亚胺得到的二亚胺使溶液呈现蓝色，并且可以在分光光度计上以370和650nm的波长读取该颜色变化。

通过加入酸或另一种终止试剂可以停止反应。使用硫酸使TMB变黄。可以在450nm处读取颜色。于它是光敏的，TMB应避免阳光直射。目前还不知道如果TMB是致癌和证据是矛盾的：TMB不是通过诱变Ames试验和不诱导在24单臂研究肿瘤形成的老鼠。根据该证据，它已被用作替代致癌化合物，如联苯胺和邻苯二胺。TMB已在逐步取代强致癌物联苯胺和其他致癌性的联苯胺衍生物，应用于临床化验、法医检验、刑事侦破及环境监测等领域；尤其是在临床生化检验方面，TMB作为过氧化酶的新底物，在酶免疫分析法（EIA）和酶联免疫吸附检验法（ELISA）中获得了广泛的应用。

研究应用^[6][7][8]

1.用于ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究

通过对间接酶联免疫测定中显色体系的各影响因素的研究,确定了酶联免疫测定的最优显色体系为二甲基亚砜(DMSO)配制四甲基联苯胺(TMB)浓度为0.3 mg/mL的溶液为A液,pH5.5,0.2 mol/L磷酸氢二钠与0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制过氧化脲素浓度为0.74 mg/mL的溶液为B液,两者按一定比例混合后使用。试验结果表明,此显色体系在25-40℃内进行都可得到较为准确的结果,且A、B液混合后在室温下放置4 h仍可使用。A液及B液分别在4℃放置60 d后混合使用仍不影响测定结果。

2.用于优化ELISA检测中TMB/HRP显色体系的研究

优化TMB/HPR显色系统的反应参数。方法:首先采用单因素试验,研究显色体系中的缓冲溶液pH、TMB浓度、H2O2浓度、反应时间和温度对显色的影响,在此基础上,再进行5因素4水平的正交试验。结果:TMB/HRP体系的最佳工作条件:缓冲液pH为5.0,TMB浓度为2.5mg/ml,H2O2浓度为0.03%(V/V),反应温度为30～50℃,反应时间为10min。结论:优化的TMB/HRP最佳反应条件,可以满足一般反应的要求,所建立的TMB/HRP体系的优化方法也适用于其它ELISA显色系统的优化。

3.3,3',5,5'-四甲基联苯胺-H2O2-辣根过氧化物酶伏安酶联免疫分析法测定人血清免疫球蛋白E

建立了一原装德国进口种与TMB-H2O2-HRP联用的IgE抗体鉴别脉冲伏定免疫分析法。HRP催化H2O2与TMB氧化产生的酶促反应产物在pH4.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，在0.10V(vs.Ag/AgCl)下表现出灵敏的伏安-ric反应。本方法对IgE抗体的检测限为4.0IU/mL，比传统的分光光度ELISA法低4倍。

参考文献

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[5] Chung K-T龙蟒钛白粉R996;Chen S-C;Claxton LD(2006)."Review of the Salmonella typhimurium mutagenicity of benzidine,benzidine analogues,and benzidine-based dyes".Mutation Research/Reviews in Mutation Research.612(1):58–76.

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[7] ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究[J].李红梅,陈佳,徐斐,曹慧,Maria Eugenia.生物技术通报.2010(02)

[8] 酶联免疫吸附试验(ELISA)三种底物的比较试验[J].张喜悦,徐天刚,王志亮,吴延功,王君玮,赵云玲,徐培莲.中国动物检疫.2003(11)