背景^[1-3]

人血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人血小板型磷酸果糖激酶(PFKP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

操作步骤

1、用缓冲液将抗体稀释至1-10ug/ml。在反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。

2、加样：加一定稀释的待检样品0.05ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml

6、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，

应用^[4][5]

用于血小板亚型磷酸果糖激酶促进肾透明细胞癌代谢重编程和细胞增殖研究

肾透明细胞癌(cc RCC)在代谢上的改变包括有氧糖酵解,提高的戊糖磷酸途径活性和降低的氧化磷酸化等。磷酸果糖激酶(PFK),糖酵解途径的关键酶,具有L、M和P亚型并在不同的组织分布。到目前为止仍然不清楚哪种亚型PFK大量表达在cc RCC中,是否在促进有氧糖酵解和大分子的生物合成,以及有支持细胞增殖的重要作用。

研究方法1.q PCR、Western blot检测肾透明细胞癌组织中PFKP、PFKM和PFKL的表达。免疫组化检测肾透明细胞癌组织中PFKP的蛋白水平。

2. q PCR、Western blot检测正常肾小管上皮细胞HK-2、肾透明细胞癌细胞系Caki-1、769-p和786-O细胞的PFKP表达。

3. si RNA干扰Caki-1、769-p和786-O细胞PFKP的表达,检测细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。

4. si RNA干扰Caki-1、769-p和786-O细胞PFKP的表达,检测细胞葡萄糖摄取、乳酸生成、氧气消耗和PFK1酶活性。

5. 建立稳转sh PFKP的Caki-1细胞,使用LCMS检测代谢组的变化。

6. 建立稳转shp53的Caki-1细胞,探索p53在抑制PFKP诱导的细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及葡萄糖摄取、乳酸台塑集团生成和氧气消耗的改变中的作用。

7. 使用稳转sh PFKP的Caki-1细胞进行裸鼠成瘤实验。

研究结果1.磷酸果糖激酶的血小板亚型(PFKP)为人类肾脏透明细胞癌主要的PFK亚型并且在肿瘤中显著上调。

2. 抑制PFKP不仅可以通过诱导细胞周期阻滞和凋亡降低肾脏透明细胞癌细胞增殖,抑制PFKP还可以导致糖酵解、戊糖磷酸途径和核苷酸合成下降,并伴有三羧酸循环激活。

3.p53基因的激活是敲低PF原装德国进口分散剂KP后肾脏透明细胞癌细胞增殖减慢及代谢异常的机制之一。

参考文献

[1]EAU Guidelines on Renal Cell Carcinoma:2014 Update[J].Borje Ljungberg,Karim Bensalah,Steven Canfield,Saeed Dabestani,Fabian Hofmann,Milan Hora,Markus A.Kuczyk,Thomas Lam,Lorenzo Marconi,Axel S.Merseburger,Peter Mulders,Thomas Powles,Michael Staehler,Alessandro Volpe,Axel Bex.European Urology.2015(5)

[2]limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies[J].Matthew E.Ritchie,Belinda Phipson,Di Wu,Yifang Hu,Charity W.Law,Wei Shi,Gordon K.Smyth.Nucleic Acids Research.2015(7)

[3]Cancer statistics,2015[J].Rebecca L.Siegel,Kimberly D.Miller,Ahmedin Jemal.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2015(1)

[4]Ischemia/reperfusion-induced upregulation of TIGAR in brain is mediated by SP1 and modulated by ROS and hormones involved in glucose metabolism[J].Meiling Sun,Mei Li,Qiao Huang,Feng Han,Jin-hua Gu,Jiaming Xie,Rong Han,Zheng-Hong Qin,Zhipeng Zhou.Neurochemistry International.2014

[5]王俊.血小板亚型磷酸果糖激酶促进肾透明细胞癌代谢重编程和细胞增殖[D].上海交通大学,2016.