背景^[1-7]

人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA KIT是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。利用产生颜色以及颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系来检测未知样品的种类及浓度。

操作注意事项

1. 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2. 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4. 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5. 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6. 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7. 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

8. 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育进口高分子絮凝剂的时间一样。

9.按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

试剂盒操作步骤:

1. 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。4.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

4. 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

5. 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

6. 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

7. 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9.在450nm波长处测定各孔的OD值。

试剂盒试剂盒性能特点：

1.灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

试剂盒结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的待测物质标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

应用^[8]

人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA KIT可用于检测人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的免疫活性：

在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表达载体的构建及在细胞中表达实验中用PCR技术扩增GPC3基因,利用酶切位点将该序列插入p3XFLAG-CMV-14载体,构建p CMV-gpc3表达载体。通过脂质体将该载体转染至HEK293细胞中,利用Western blot技术检测最终结果。收集稳定表达的细胞,破碎,通过亲和层析柱,获得纯度较高的GPC3蛋白。但在后续实验前需要检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的免疫活性及浓度才能保证后续免疫试验的成功。

参考文献

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[7]Glypican 3 and glypican 4 are juxtaposed in Xq26.1[J].Reid Huber,Richard Mazzarella,Chun-Nan Chen,Ellson Chen,Maggie Ireland,Susan Lindsay,Giuseppe Pilia,Laura Crisponi.Gene.1998(1)

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