背景^[1-3]

碳酸锂胭脂红染色液是conn改良Weigert革兰染色液的一种,用于细菌革兰染色。革兰氏染色（Gram Staining）是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同，可将细菌分成两类，即革兰氏阳性（Gram Positive）与革兰氏阴性（Gram Negative）。这一染色方法由丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系，后推广为鉴别细菌种类的重要特性之一，对由细菌感染引起的疾病的临床诊断及治疗有着广泛用途。

原理通过结晶紫初染和碘液媒橡胶助剂染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌2.选择药物3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂多糖，两者的致病作用不同。

应用^[4][5]

用于临床常见细菌和真菌快速检测方法的初步研究

细菌和真菌感染是临床常见的感染性疾病,发病率和死亡率高,如果得不到早期的诊断和治疗,会严重危及患者的生命。传统的培养法、生物化学检测和免疫学检测等方法,缺乏敏感性和特异性,不能早期快速的诊断病原菌感染,因此,寻找快速的诊断方法至关重要。建立同时检测和鉴别革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌的TaqMan探针法荧光定量PCR,早期快速的诊断致病菌感染。

方法：在GenBank数据库中查找20种细菌的16S rRNA基因序列和7种真菌的18SrRNA基因序列,应用ClustalX软件比对序列,找出各自的保守序列。使用Primer Express2.0和Oligo6.0软件,按照引物和探针设计的一般原则,在细菌的保守区筛选出细菌的通用引物和革兰分型探针,在真菌的保守区筛选真菌的通用引物和通用探针。革兰阳性探针和真菌探针的5’端标记荧光报告集团FAM,革兰阴性探针的5’端标记荧光报告集团HEX,它们的3’端均标记TAMRA荧光淬火基团。

细菌的扩增片段长度为229bp,真菌的扩增片段长度为276bp,引物和探针均在Invitrogen公司合成。优化荧光定量PCR反应体系,细菌的两个分型探针在同一个管中,真菌的探针在单独的管中,即同一个模板进行细菌和真菌的平行反应,每次反应均设置阳性对照、阴性对照和无模板的空白对照,所有反应均在ABI7500荧光定量PCR仪器上进行。检测11种革兰阳性细菌、9种革兰阴性细菌和7种真菌的标准菌株或者临床分离菌株,同时检测乙肝病毒DNA和人的基因组DNA,以观察所建立方法的特异性。

参考文献

[1]Acute bacterial meningitis in infants and children[J].Kwang Sik Kim.The Lancet Infectious Diseases.2010(1)

[2]Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)for clinical detection of Plasmodium falciparum gametocytes[J].Sureemas Buates,Sirasate Bantuchai,Jetsumon Sattabongkot,Eun-Taek Han,Takafumi Tsuboi,Rachanee Udomsangpetch,Jeeraphat Sirichaisinthop,Peerapan Tan-ariya.Parasitology International.2010(3)

[3]Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma[J].V.Herrera,J.Parsonnet.Clinical Microbiology and Infection.2009(11)

[4]Rapid detection of eight causative pathogens for the diagnosis of bacterial meningitis by real-time PCR[J].Naoko Chiba,Somay Y.Murayama,Miyuki Morozumi,Eiichi Nakayama,Takafumi Okada,Satoshi Iwata,Keisuke Sunakawa,Kimiko Ubukata.Journal of Infection and Chemotherapy.2009(2)

[5抗氧剂]韩慧.临床常见细菌和真菌快速检测方法的初步研究[D].南方医科大学,2012.