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alpha-淀粉酶的制备方法
背景及概述[1]
alpha-淀粉酶即α-淀粉酶,广泛存在于生物界。alpha-淀粉酶能够催化随机水解淀粉的 α‑1,4‑糖苷键,产生麦芽糖、麦芽三糖和α糊精。alpha-淀粉酶广泛应用于饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和医药等行业。
制备[1]
(1)载体pxmj19-aph213的制备。
载体pxmj19-aph213的构建过程如下:
以引物aph213F和aph213R从载体xk99e载体上扩增出aph213基因,所用的引物如下:
aph213F:ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac
aph213R:ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg
PCR条件如下:95℃ 4min;95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min,35个循环;72℃ 7min。
上述引物的设计使得aph213基因扩增过程中,在aph213基因上游形成EcoRV切点、下游形成HindIII 切点,aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;回收PCR产物并以EcoRV和HindIII酶切,通过T4DNA连接酶,连接到同样经过EcoRV和HindIII酶切的载体pxmj-19上,获得载体pxmj19-aph213。
载体pxmj19-aph213的扩增过程如下:
a、在50ml离心管中加入3ml的LB培养基,加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素;
b、挑取带有载体pxmj19-aph213的大肠杆菌DH5α转接至上述培养基中,在37℃,230rpm的条件下培养12h,以扩增pxmj19-aph213质粒;
c、根据质粒提取试剂盒的说明书提取pxmj19-aph21pvc复合稳定剂3质粒。
(2)枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶基因的扩增与改造。
以引物AmyF和AmyR从枯草芽孢杆菌的基因组上扩增出α-淀粉酶基因,所用的引物如下:
AmyR:ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag;
AmyF:ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc;
PCR条件如下:95℃ 4min;95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min,35个循环;72℃7min。
上述引物的设计使得α-淀粉酶基因扩增过程中,在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成组无泡表面活性剂氨酸标签,上游酶切位点为HindIII,下游酶切位点为XhoI;
(3)构建重组载体。
回收PCR产物并用XhoI和HindIII酶切,通过T4DNA连接酶,连接到同样经过XhoI和HindIII酶切的载体pxmj19-aph213上,获得重组表达载体pxmj19-aph213-amy。
(4)构建重组菌。
将重组表达载体pxmj19-aph213-amy转入大肠杆菌中进行预扩增,培养基为LB培养基,氯霉素浓度为50ug/ml;提取后,用电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌中,在LBHIS恢复培养基中30℃培养,氯霉素浓度为30ug/ml。
(5)培养重组菌,分泌表达α-淀粉酶。
将长出的转化子转接到装有50ml培养基的250ml的三角瓶中进行培养,培养基为BHI培养基,培养条件为30℃,230rpm,48h。
(6)α-淀粉酶的纯化。
a、将重组菌的培养物进行离心,12000rpm、4℃、5min,获得含有α-淀粉酶的上清。
b、将含有α-淀粉酶的上清进行亲和层析,首先用缓冲液A平衡镍柱,将含有α-淀粉酶的上清过滤并上样至平衡后的镍柱,继续用缓冲液A平衡至基线水平后继续平衡3个柱体积;用100mmol的B液洗脱,收集洗脱的洗脱液,每管收集0.5ml;
缓冲液A为:300mM NaCl,20mM Tris,pH8.0的缓冲液,缓冲液B为:300mM NaCl,250mM 咪唑,20mM Tris,pH8.0的缓冲液。
c、对含有α-淀粉酶的洗脱液通过脱盐柱进行脱盐,获得纯化的α-淀粉酶溶液,-20℃保存;
脱盐用的缓冲液为50mM的PBS缓冲液,pH为7.0。
参考文献
[1] [中国发明,中国发明授权] CN201610836135.0 α-淀粉酶的制备方法【公开】/α-淀粉酶的制备方法【授权】
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