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淀粉肽的制备
概述[1]
淀粉肽在体外容易形成包含纤维和不具有纤维形态的高分子量或低分子量聚集物在内的混合物。这种组分不均一的混合物影响研究的准确性和可靠性。因此,获得稳定均一的低分子量Aβ寡聚体对科研工作非常重要。
众多学者曾采用多种方法制备Aβ寡聚体,但收率和效果比较低,并且所得Aβ寡聚体的成分不均一,含有较多成分的高分子量聚集物和纤维状成分,难以进一步提纯。如利用化学交联法制备的寡聚体在成分上有差异,不能真实反应低分子量Aβ寡聚体的作用特点。而且各制备方法的条件不稳定,所得结果难以比较。有些方法和材料具有较大的不良反应,影响试验者和应用者的健康。
制备[2]
目前淀粉肽的常规制备方法有生物法和化学法两种,生物法是通过基因蛋白表达来制备,CN200810025285公开了一种制淀粉肽的方法,生物法由于其工 艺复杂,可变因素多,成本昂贵,不利于后期产业化。而常规的化学合成法由于其序列第29- 42位氨基酸的极度疏水性,容易形成β折叠构象,会导致氨基被包裹在折叠肽序中不易暴露 出来,加大了后续氨基酸的偶联难度,同时也降低了茚三酮检测的灵敏性,容易造成假阴性 的现象。导致偶联不完全,缺省肽杂质的产生,后续纯化难度增加,收率降低。
具体方法:
(1)制备Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂
称取HMP-TentaGel 树脂 20克(取代度1.0mmol/g)置于玻璃反应柱中,加入DCM浸泡30 分钟,抽干,加入Fmoc-Ala-OH 3.74g(12mmol),TBTU 3.86g(12mmol), HOBT 1.63g (12mmol) DIEA 3.1g(24mmol),加入体积比为1:1的DMF/NMP混合液溶解,通氮气鼓泡反应8 小时,抽干,用DMF洗涤3次,再加入体积比2:2:1的乙酸酐:吡啶:DMF的混合溶液,反应0.5小 时,抽干,用DMF洗涤6次,抽干,获得Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g(10mmol Loading =0.45mmol/g)。
(2)制淀粉肽树脂肽
在Fmoc-Ala-HMP-TentaGel 树脂 22.3g(10mmol)中加入体积比20%的PIP/DMF的脱帽 试剂,通氮气鼓泡反应30分钟,抽干,用DMF洗涤5次,抽干;加入Fmoc-Ile-OH 7.07g (20mmol),DIC 2.53g(20mmol),HOBT 2.71g(20mmol),DIEA 5.17g(40mmol),加入DMF溶解, 通氮气鼓泡反应4小时,茚三酮法检测反应终点,抽干,用DMF洗涤3次,抽干,获得Fmoc-Ile- Ala-HMP-TentaGel 树脂;然后再加入脱冒试剂,脱保护反应,再依次加入保护氨基酸,如此 反复,直至连完最后一个有机硅涂料助剂天冬氨酸,脱保护反应,DMF洗涤5次,甲醇洗涤2次收缩树脂,抽真 空干燥24小时,得到淀粉肽树脂肽86.7g;
每一步缩合反应所加入的氨基酸的量都为20mmol,缩合剂的量都为DIC 2.53g (20mmol),HOBT 2.71g(20mmol),DIEA 5.17g(40mmol)。
(3)制淀粉肽
取步骤(2)中淀粉肽树脂肽86.7g置于2L的圆底烧瓶中,加入0.9L切割试剂,配 比为TFA:EDT:TIS:H2O=90%:5%:3%:2% (v/v),置于恒温摇床中25℃振荡反应2小时,抽滤滤 掉树脂颗粒,收集滤液,然后加入4.5L乙醚结晶沉淀,离心收集沉淀,再用乙醚洗涤6次,真 空干燥,获得淀粉肽粗品43.5g,HPLC检测粗品纯度48.7%,再经高效液相色谱分离 纯化、冻干后得到淀粉肽精品9.5g,总收率达到21.1%。
主要参考资料
[1] 陈蕾, 刘长金, 唐明,扬子巴斯夫 李爱, 胡新武, & 周莹, et al. . β-淀粉肽(1-40)对海马神经元高电压激活钙电流的作用及银杏内酯b对该作用的影响. 生理学报, 58(1), 14-20.
[2] 肖幸丰, 郑明, 瞿林海, 张幸国, & 楼宜嘉. . 淫羊藿苷伍用三七总皂苷对aβ-淀粉肽25-35侧脑室注射所致大鼠行为异常及脑组织ache活性的影响. 中国现代应用药学, 20(3), 20-20.
[3] 邢爱平[1], 施万英[2], 任亚浩[1], 赵越[1], 张玉莹[3], & 安丽[1]. . β-羟基丁酸通过抑制hdac1/3上调β样淀粉肽处理的sh-sy5y细胞trka的表达. 实用预防医学.
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